Selective mastoporan inhibition of muscarinic activation of bovine tracheal smooth muscle

Muscarinic activation of bovine tracheal smooth muscle (BTSM) leading to smooth muscle contraction involves the generation of two cGMP signals (20 and 60 s), being 20s peak associated with soluble (sGC) and the second (60s) to membrane-bound Natriuretic Peptide- receptor-Guanylylcy clases (NPR-GC). In this study, we showed that pre-incubation of isolated BTSM strips with mastoparan and superactive mastoparan (mastoparan 7) decreased significantly the muscarinic dependent contractile smooth muscle responses in dose-dependent and non-competitive manner. Moreover, mastoparan (50 nM) inhibited completely the BTSM-muscarinic contractile responses and affected dramatically the carbachol-dependent cGMP signals being the first cGMP signal inhibited in a 63 ± 5%, whereas the second signal disappeared. Mastoparan inhibition of muscarinic activation is specific since other spasmogens as serotonin and histamine fully contracted these BTSM strips under mastoparan treatment. Cyclic GMP levels were evaluated by exposing BTSM strips to activators of NO-sensitive sGC as Sodium Nitroprussiate (SNP) and Natriuretic Peptides as CNP-53 for membrane-bound NPR-GC. Thus, SNP and CNP increased in a binary way, in more than 20 fold cGMP levels at 30-40 s being both increments inhibited by mastoparan. Furthermore, the Gi/o-protein involvement on mastoparan inhibition of cGMP elevations induced by CNP and SNP is suggested by Pertussis toxin pre-treatment, which reversed mastoparan effects. These results indicate that muscarinic signal transduction cascades leading to airway smooth muscle contractions involved two different guanylyl cyclases being both regulated by mastoparan-sensitive G-proteins. ANP, Natriuretic Peptide type A; ASM, Airway Smooth Muscle; BTSM, Bovine Tracheal Smooth Muscle; CNP-53, Natriuretic Peptide type C-53; GPCR, G-Protein Coupled Receptor; Gq16, Heterotrimeric G protein subtype 16; Gi/o, Heterotrimeric G protein subtype...

La activación muscarínica del músculo liso de las vías aéreasrelacionada a la contracción de dicho músculo liso esta asociada a la generación de dos señales de GMPc (20 y 60 s), siendo la señal de los 20s relacionado a la activación de la guanililciclasa soluble mientras que el pico de los 60s a la guanililciclasa unida membranas y sensible a péptidos natriuréticos (NPR-GC). En este trabajo, nosotros mostramos que la pre-incubación de fragmentos del músculo liso traqueal de bovino (BTSM) con mastoparan y su análogo superactivo (mastoparan 7), en una forma dosis dependiente, son capaces de disminuir de manera significativa la actividad contráctil dependiente de agentes muscarinicos. Adicionalmente, mastoparan (50 nM) inhibió completamente la respuesta contráctil muscarinica del BTSM y afectó dramáticamente los picos de GMPc asociados a la activación muscarinica siendola primera señal inhibida en un 63 ± 5%, mientras que la segunda señal desapareció completamente. Esta inhibición del mastoparan de la activación muscarínica es especifica ya que otros espamogenos como la serotonina y la histamina fueron capaces de inducir respuestas máximas en presencia del mastoparan y su análogos. Este efecto del mastoparan sobre los niveles del GMPc fue evaluado en presencia de otros agentes generadores de este segundo mensajero como son el nitroprusiato de sodio (SNP) que activa la guanililciclasa soluble sensible a NO y los péptidos natriureticos como el CNP-53 (CNP) activador de la NPR-GC asociada a membranas plasmáticas. Tanto, el SNP como el CNP aumentaronen mas de 50 veces los niveles de GMPc a los 30-40 s en forma bifasica, siendo estos incrementos inhibidos de manera significativa por el mastoparan. Ademas, se sugiere la participación de proteínas Gi/o en los efectos inhibitoriosdel mastoparan, porque la Toxina pertussis revertió los efectos inhibitorios. Estos resultados indican que la cascada de activación muscarinica que conduce...

The mechanism of cancer involves short interfering (RNA) (siRNA)

The recent discoveries of the RNA-mediated interference system in cells could explain all of the known features of human carcinogenesis. A novel idea, proposed here, is that the cell has the ability to recognize a mutated protein and/or mRNA. Secondly, the cell can generate its own short interfering RNA (siRNA) using an RNA polymerase to destroy mutated mRNA, even when only a single base pair in the gene has mutated. The anti-sense strand of the short RNA molecule (called sicRNA), targets the mutated mRNA of an oncogene or a tumour suppressor. During cell mitosis, the sicRNA complex can move into the nucleus to target the mutated gene. The sicRNA triggers the assembly of protein complexes leading to epigenetic modification of the promoter site of the mutant gene. In some instances, instead of methylation, the homologous DNA is degraded, leading to loss of heterozygosity. The factors controlling these two actions are unknown but the result is gene silencing or physical destruction of the mutant gene. An error in RNAi defence occurs when the sicRNA during methylation of the target gene, inadvertently interferes with the production of a miRNA specific for that tissue. This produces a change in the profile of correct proteins for that tissue. On a rare occasion, a preneoplastic stem cell will survive if miRNA interference switches on/off a gene involved in apoptosis, as well as a gene involved in cell proliferation and DNA damage surveillance. The driving force of carcinogenesis is the sequential loss of specific miRNAs.

Papel de las PDE Ic en la contracción del músculo liso de las vías aéreas: futuras drogas broncorelajadoras / Peiper of the PDE Ic in the contraction airway smooth muscle bronchorelaxing drugs future

En el músculo liso traqueal, los antagonistas muscarínicos (atropina) incrementan simultáneamente los niveles basales de los nucleóticos cíclicos (AMPc, GMPc), dependiendo del tiempo y dosis con máximo a 15 min y pEC50 7.4 mas o menos 0.2. El IBMX (10 µM), inhibidor no selectivo de PDEs, induce una respuesta similar. Sin embargo, la atropina potencial los incrementos del AMPc inducidos por 10 µM Rolipram (inhibidor PDE-IV) y los del GMPc producidos por µM Zaprinast (inhibidor PDE-V), sugiriendo la inhibición de una PDE que hidrolice ambos nucleótidos. La Vinpocetina (20 µM), inhibidor de PDE-Ic no dependiente de Calmodulina, produjo una respuesta semejante al antagonista muscarínic. Además, la atropia inhibió la PDE-Ic de las membranas celulares y no afectó la PDE-I cistosólca. Los antagonistas muscarínicos actúan como "agonistas inversos" sobre los m2/m3 AChR del sarcolema, iniciando una novedosa cascada que inhibe la PDE-Ic, provocando el incremento simultáneo del AMPc y GMPc en este tejido

Muerte por concusión cardíaca: a propósito de un caso médico-legal / Death by cardiaca concussion: of a medical-legal case

En el presente trabajo se describe el primer caso en Venezuela de una autopsia medico legal de un joven de 13 años de edad, quien durante su participación en una competencia de karate presentó muerte súbita por paro cardíaco luego de un golpe no penetrante en el pecho, en ausencia de lesiones traumáticas en corazón y grandes vasos. De acuerdo a los criterios establecidos por Maron y col 23 este caso parece coincidir con un diagnóstico de commotio cordis o concusión cardíaca

La guanililciclasa acoplada a proteínas G: un novedoso sistema de transducción de señales en el músculo liso de las vías áereas / The guanylylcyclases adjusted G protein: a system of transduction new of sings in the airway smooth muscle

Las guanililciclasas (GCs) son enzimas reponsables de la formación del GMP cíclico a partir del GTP. En las células de mamíferos hay 2 sistemas implicados en la síntesis del GMPc. Así, una GC soluble de naturaleza hemoproteica, es el receptor intracelular al óxido nítrico (NO) vinculado a la formación de GMPc que participa en la relajación del músculo liso vascular. Un segundo grupo esta integrado por las GC asociadas a membranas, que pueden ser clasificadas como 1.-GC activadas por el Ca²+.2.- Las GC sensibles a péptidos natriuréticos (NP-GCs) GC-A,B y C. 3.- Las GC asociadas a receptores "huerfanos" (GC-D,E,F,G) 4.- Las GC acopladas proteínas G. Este último tipo de GC es el motivo de esta revisión. Nuestros resultados demostraron por primera vez que existe una GC acoplada a proteínas G en una fracción de menbrana plasmática del músculo liso de las vías aéreas. Esta enzima es activada por agonistas muscarínicos requeriendo NaCI para dicha activación. Esta activación muscarínica es mediada a través de un receptor muscarínico M3 mAChR acoplado a una proteína G insensible a toxina pertussis (PTX) denominada GA. Aún mas, una inhibición muscarínica fue también observada y es por un receptor M2 AChR acoplado a una proteína G sensible a PTX del tipo Gi/o. Recientemente hemos encontrado que la GC acoplada a proteínas G es una isoforma de la NP-GC-B, lo cual sugiere un estrecha comunicación de la cascada de señalización de los receptores muscarínicos y la GC estimulada por CNP. Estos resultados originales arrojaran nuevas ideas sobre el papel del músculo liso de las vías aéreas en la fisiopatología del asma broquial

Regulation of histamine secretion in a mast cell line

La interacción del alergeno con su lg-E específica anclada en la superficie externa de la membrana plasmática del mastocito desencadena la liberación de histamina de dicha célula. Este proceso requiere la presencia de calcio extracelular y de energía bajo la forma de ATP proveniente fundamentalmente de glicólisis donde el lactato es el producto final. La heterogeneidad de los mastocitos ha sido previamente descrita en diversos tejidos de diferentes especies animales. Así, esta línea celular tumoral en ratones LAF1 mostró propiedades similares a las descritas para los mastocitos presentes en la cavidad peritoneal de la rata. Las respuestas metabólicas relacionadas a la secreción de histamina también fueron estudiadas en esta línea de mastocinoma, que exhibieron un comportamiento diferente dependiendo del secretagogo utilizado. En este sentido, una fuerte estimulación de la glicólisis fue observada la presencia de Concanavalina-A en comparación con la estimulación inducida por el A-23187 y el compuesto 48/80. En este modelo experimental se logró establecer relaciones entre la liberación de histamina con el consumo de glucosa, la produción de lactato y la carga adenílica bajo la forma de ATP

La activación muscarínica del músculo liso de las vías aéreas / The muscarinic activation of smooth muscle of airway

La activación de receptores muscarínicos del músculo de las vías aéreas provoca la generación de varios segundos mensajeros (AMPc e GMPc e IP3). La activación del receptor muscarínico M3 producida por el carbacol induce a incrementos significativos en los segundos mensajes antes mencionados. Después de la adición de carbacol, una cinética diferente fue encontrada para estos segundos mensajeros. El IP3 mostró un primer pico (10 seg), el cual precede el inicio de la contracción muscular lisa. Además, un segundo pico de este segundo mensaje de inositol fue detectado a los 60 segundos. Con respecto a los nucleótidos ciclicos, el AMPc mostró un solo pico a los 20 segundos y el GMPc mostró la existencia de dos picos. Así, este último nucleótico mostró un primer pico a los 20 segundos, el cual coincide con el pico de AMPc y un segundo pico a los 60 segundos, después que la contracción muscular lisa se estabilizó. El último pico parece ser sensible a los atrapadores de grupos NO como es el azul de metileno, sugiriendo a la guanililciclasa soluble como la enzima responsable de este segundo pico. Adicionalmente; el KCL es capaz de inducir la contracción del músculo liso que parece ser diferente en varios aspectos a la activación muscarínica del músculo liso de las vías aéreas

Subcellular distribution and pharmacological characterization of muscarinic receptors in tracheal smooth muscle

: Subcellular fractions isolated from tracheal smooth muscle have been identified using biochemical markers and measuring the [3H]QNB muscarinic receptor binding activity in these fractions. This muscarinic receptor (mAchR) activity was slightly enriched 1.6 times in the crude mitochondrial fraction (M), 2.6 times in the crude microsomal fraction (P), and greatly enriched in the highly purified plasma membranes fractions, being 5.3 times in a heavy plasma membrane fraction designed as P2 and 9.1 times in a light plasma membrane fraction named P1 fraction. The muscarinic receptor subtypes present in the subcellular fractions were identified using competition experiments. The binding of five selective antagonists, pirenzepine, AF-DX 116, hexahydrodifenidol, methoctramine and 4-DAMP were examined. In this sense, the M1 antagonist pirenzepine showed pKi's values between 6.44-7.45 and the M2 antagonist AF-DX 116 showed pKi's values ranging from 6.75 to 7.45 being the lowest pKi's values here described. The antagonist hexahydrodifenidol showed higher affinities than pirenzepine-derivated compounds with pKi's values from 7.25 to 7.65. The antagonist 4-DAMP exhibited pKi's values from 8.18-8.41. Finally, methoctramine showed similar affinities as 4-DAMP, with pKi's ranging from 8.09 to 8.22 suggesting the existence of M2 receptors in these fractions. These data suggest that M2 mAchR are present in all articulate fractions here studied. It is important to emphasize that the M2 muscarinic receptor presents in the light plasma membrane fraction (P1) shows poor selectivity towards the muscarinic antagonists being different from the M2 mAchRs associated with other subcellular fractions isolated from bovine tracheal smooth muscle

NaCl increases the dissociation constant (Koff) of 3H-QNB muscarinic receptor complex in an airway smooth muscle plasma membrane fraction

Muscarinic receptors associated to plasma membrane fractions isolated from bovine airway smooth muscle were previously characterized by using 3H Quinuclidinyl-benzilate (3H-QNB) binding (Bécemberg, et al. Arch. Venez. Farm Terap. (1986) 5: 244-256). 3H-QNB binding to P1 plasma membrane fraction was time dependent. In order to study the effect of NaCl on the ligand binding properties of muscarinic receptor, a kinetic approach for the evaluation of koff of the 3H-QNB muscarinic receptor complex (QNB-mR) perfomed in the presence or absence of NaCl is done. The 3H-QNB bound to the receptor is released by atropine through an exchange reaction at the antagonist binding site. NaCl decreases the t1/2 of complexes and increases the velocity of dissociation of 3H-QNB-mR producing a significant change in Koff values, whichever conditions the 3H-QNB-mR complexes are formed. Pretreatment of P1 plasma membranes fraction with N-ethyl maleimide (1mM NEM) does not alter Koff value. In addition, in these NEM-treated P1 membranes, NaCl is unable to further increase the Koff value. The effect of NEM blocking this "activator effect" of NaCl suggests thar sulphydryl groups in the receptor structure may be involved in this NaCl effect on the 3H-QNB binding to muscarinic receptors

Biochemical and pharmacological characterization of octylglucoside-solubilized muscarinic receptors derived from bovine tracheal smooth muscle

La actividad de receptor colinérgico muscarínico fue investigada en las fracciones subcelulares del músculo liso traqueal de bovino. Esta actividad de receptor muscarínico fue determinada mediante un ensayo basado en la unión específica del H-QNB (antagonista muscarínico Bencilato de Quinuclidinilo tritiado) utilizando un método simple y reproducible que permite separar el ligando radioactivo que se encuentra libre del unido, mediante un procedimiento de centrifugación en columnas; lo cual permite obtener valores muy bajos como "blanco". Esta actividad de receptor muscarínico fue encontrada enriquecida 4 veces en la fracción microsomal (P) con respecto al Extracto original y después de una etapa adicional de purificación utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa se concentró 7 veces dicha actividad en la fracción de membranas plasmáticas (P-1). A partir de esta fracción de membranas plasmáticas enriquecida en receptor muscarínico y utilizando un método original que emplea un detergente no iónico como es el Octilglucósido al 1% se obtuvo una fracción de receptor muscarínico "solubilizado", después de centrifugar a 200.000 x g x 30 min. El material solubilizado fue filtrado a través de una columna de Sephadex G-50, con la finalidad de remover el detergente y el eluente obtenido de esta columna se denominó receptor muscarínico "solubilizado". El procedimiento descrito inicialmente para evaluar la interacción entre el receptor muscarínico y el H-QNB, también permite determinar bajo las mismas condiciones experimentales, la unión del H-QNB, tanto a los receptores muscarínicos unidos a las membranas plasmáticas como a los receptores presentes en el "solubilizado". Se encontró que el receptor muscarínico "solubilizado" y el asociado a las membranas plasmáticas mostraron idénticas propiedades bioquímicas y farmacológicas